有没有生物医学方面做小白鼠灌流实验的高手？

    最近，想做小白鼠灌流实验，自己经验不多，希望高手指点。以下信息来自网络，看看有没有问题。先谢谢了。

1，离体心脏灌注实验（langendorff experiment）：在摘取麻醉的动物活体心脏之后用固定液灌流心脏。

（1）需要足够细的主动脉插管，可以购买灌流针，也可以利用200ul的枪头自己烧制，最好能使尖端带有凹槽以利于系线固定（枪头有凹槽），头皮针太滑、太尖。

（2）足够快的解剖操作，准确地将主动脉灌流针（或自制插管）插到主动脉（aorta，artery）根部，而不刺破主动脉瓣（aortic vaives）。

（3）减少插管前心脏的代谢，但是用冰水容易使主动脉回缩。

（4）灌流针从左心间插入，一般深度到达左动脉弓（aortic arch，arterial arcades）为宜，此时隐约能明显看到针尖在动脉弓的位置。

（5）为了方便固定，可以用小号止血钳夹住进针的位置，打开灌流器（蠕动泵之类），调节流速（这个值一般靠经验），开始灌注。

        2，活体灌注固定实验（perfusion-fixed experiment）：就是在麻醉的动物活体时通过心脏将4％的多聚甲醛（PFA）固定液灌流到全身。

（1）小鼠麻醉后，用大头针固定四肢在泡沫板上。灌流器要事先准备好。

（2）剪开胸腔暴露心脏，用20ml注射器（尖端用血管钳弄钝，避免刺破心脏或主动脉）从心尖（apex）插入至升主动脉（ascending aorta，发自左心室，位于肺动脉干与上腔静脉之间，向右前上方至右侧第2胸肋关节后方移行为主动脉弓，升主动脉根部发出左、右冠状动脉），用血管钳固定针尖，也可以用镊子固定针头。注意：针头不要扎得太深，进入左心室就可以了，不用非得进入主动脉，太深的话，扎破了室间隔进入肺循环后，肺就很快白了。

（3）用生理盐水（normal saline，用于两栖类动物时是0.67～0.70％，用于哺乳类动物和人体时是0.85～0.9％，人们平常点滴用的氯化钠注射液浓度是0.9％）或者pbs快速先冲洗，

（4）待小鼠快变成“气球小鼠”之前（其实很快，也就打开灌流器之后30秒不到），可以观察灌流器工作阻力明显增加，剪刀剪开右心包（也有剪右心耳的），让灌流液流出。

（5）期间会观察到的现象：四肢抽搐，鼠尾先翘起后僵直，肝脏颜色变浅，鼠口鼻中有白色泡沫涌出，肠道颜色稍有变化，但不是很明显。

（6）用4％多聚甲醛缓慢冲洗灌注（也可以用注射器，但必须是技术相当熟练）。判断灌注效果好不好的标志是：鼠尾僵直；肝脏变成浅色，有的人直接描述为发白。

（6）灌流只是临时固定，以便取较脆弱的组织（如脊髓和脑组织），取出来后的组织放到取材体积20倍的多聚甲醛溶液中固定。

（7）决定灌注质量的额外因素：小鼠麻醉剂量要合适，不能让它麻醉过量；剪开胸腔前做好灌注准备，剪开之后立即操作。

（8）中心原则：一定要在灌流液进入之前，保证老鼠存活，血液循环畅通。

（9）如果要保留完好心脏，则可以绕过左心尖，直接从主动脉弓进针，可以直接将主动脉弓截断，伤口进针，下口止血钳封闭，灌注差不多时，就不用剪开右心包，直接打开下口。

（10）注射器灌注，由于压力不好控制，容易导致小血管破裂，片子形态不好。

（11）盐水一般30－50ml，PFA一般50mL左右，在换液时不要移动针头。

    3，活体麻醉问题

       （1）1％戊巴比妥钠，80mg/kg效果很好。

       （2）腹腔注射（IP）麻醉，药物由腹腔粘膜吸收；如果误打进了肠腔或膀胱就会导致效果不理想。

       （3）保证注入腹腔的办法：拇指和食指捏住小鼠头部皮肤，小鼠背靠手掌，将尾巴固定在小指和无名指缝中，此时小鼠牢固被固定在左手中。

       （4）看到小鼠的髂骨上缘了吗？1mL的注射器沿髂骨上缘（大概是大腿前沿）水平进针，针尖的开口要向上（向外）；水平，是指沿小鼠的左右。进针后稍微摇动针尖，这样即使针尖进入了肠腔，一摇自然就出来了。然后控制好量缓缓注射。

       （5）2％的戊巴比妥纳效果也很好，剂量45mg/kg体重腹腔注射，约十分钟达到最佳的麻醉状态。

      （6）其它麻醉方法：氯胺酮（8 mg/ 100 g）；10％水合氯醛，3ml/kg；用麻醉机吸入麻醉剂（异氟醚）。

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